Ett fluorescensfilter är en viktig komponent i fluorescensmikroskop.Ett typiskt system har tre grundläggande filter: ett excitationsfilter, ett emissionsfilter och en dikroisk spegel.De är vanligtvis förpackade i en kub så att gruppen sätts in tillsammans i mikroskopet.
Hur fungerar ett fluorescensfilter?
Excitationsfilter
Excitationsfilter sänder ljus av en specifik våglängd och blockerar andra våglängder.De kan användas för att producera olika färger genom att justera filtret så att endast en färg går igenom.Excitationsfiltren finns i två huvudtyper - långpassfilter och bandpassfilter.Exciteraren är vanligtvis ett bandpassfilter som endast passerar de våglängder som absorberas av fluoroforen, vilket minimerar excitation av andra fluorescenskällor och blockerar excitationsljus i fluorescensemissionsbandet.Som visas av den blå linjen i figuren är BP 460-495, vilket betyder att det bara kan passera genom fluorescensen på 460-495nm.
Den placeras inom belysningsbanan för ett fluorescensmikroskop och filtrerar bort alla våglängder av ljuskällan förutom fluoroforexcitationsområdet.Filtrets minsta överföring dikterar ljusstyrkan och briljansen hos bilder.Minst 40 % transmission för valfritt excitationsfilter rekommenderas så att transmissionen helst är >85 %.Bandbredden för excitationsfiltret bör vara helt inom fluoroforexcitationsområdet så att filtrets centrumvåglängd (CWL) är så nära som möjligt den maximala excitationsvåglängden för fluoroforen.Excitationsfiltrets optiska densitet (OD) dikterar bakgrundsbildens mörkhet;OD är ett mått på hur väl ett filter blockerar våglängderna utanför överföringsområdet eller bandbredden.En minsta OD på 3,0 rekommenderas men en OD på 6,0 eller högre är idealisk.
Emissionsfilter
Emissionsfilter tjänar syftet att tillåta den önskvärda fluorescensen från provet att nå detektorn.De blockerar kortare våglängder och har hög transmission för längre våglängder.Filtertypen är också associerad med ett nummer, t.ex. BA510IF i figuren (interferensbarriärfilter), som beteckningen hänvisar till våglängden vid 50 % av dess maximala transmission.
Samma rekommendationer för excitationsfilter gäller för emissionsfilter: minimal överföring, bandbredd, OD och CWL.Ett emissionsfilter med den perfekta CWL, minimala transmissionen och OD-kombinationen ger ljusast möjliga bilder, med djupast möjliga blockering, och säkerställer detektering av de svagaste emissionssignalerna.
Dichroisk spegel
Den dikroiska spegeln placeras mellan excitationsfiltret och emissionsfiltret i en 45° vinkel och reflekterar excitationssignalen mot fluoroforen samtidigt som den sänder emissionssignalen mot detektorn.Idealiska dikroiska filter och stråldelare har skarpa övergångar mellan maximal reflektion och maximal transmission, med en >95 % reflektion för excitationsfiltrets bandbredd och en transmission på >90 % för emissionsfiltrets bandbredd.Välj filtret med fluoroforens skärningsvåglängd (λ) i åtanke, för att minimera ströljus och maximera fluorescerande bildsignal-till-brusförhållande.
Den dikroiska spegeln i denna figur är DM505, så namngiven eftersom 505 nanometer är våglängden vid 50 % av den maximala transmissionen för denna spegel.Transmissionskurvan för denna spegel visar hög transmission över 505 nm, en brant nedgång i transmissionen till vänster om 505 nanometer och maximal reflektivitet till vänster om 505 nanometer men kan fortfarande ha viss transmission under 505 nm.
Vad är skillnaden mellan långpass- och bandpassfilter?
Fluorescensfilter kan delas in i två typer: långpass (LP) och bandpass (BP).
Långpassfilter sänder långa våglängder och blockerar de kortare.Cut-on-våglängden är värdet vid 50 % av topptransmission, och alla våglängder ovanför cut-on sänds av långpassfiltren.De används ofta i dikroiska speglar och emissionsfilter.Långpassfilter bör användas när applikationen kräver maximal emissionsinsamling och när spektral diskriminering inte är önskvärd eller nödvändig, vilket i allmänhet är fallet för sonder som genererar en enda emitterande art i prover med relativt låga nivåer av bakgrundsautofluorescens.
Bandpassfilter sänder bara ett visst våglängdsband och blockerar andra.De minskar överhörning genom att endast tillåta den starkaste delen av fluoroforemissionsspektrumet att sändas, minskar autofluorescensbrus och förbättrar därmed signal-brusförhållandet i autofluorescensprover med hög bakgrund, vilket långpassfilter inte kan erbjuda.
Hur många typer av fluorescensfilterset kan BestScope leverera?
Några vanliga typer av filter inkluderar blå, gröna och ultravioletta filter.Som visas i tabellen.
| Filteruppsättning | Excitationsfilter | Dichroisk spegel | Barriärfilter | LED-lampa Våglängd | Ansökan |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Fluorescerande antikroppsmetod ·Acidin orange: DNA, RNA ·Auramin: Tuberkelbacill ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | ·Rhodamine, TRITC: Fluorescerande antikroppsmetod ·Propidiumjodid: DNA ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | · Autofluorescensobservation ·DAPI: DNA-färgning ·Hoechest 332528, 33342: används för kromosomfärgning |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | · Katekolaminer ·5-hydroxitryptamin ·Tetracyklin: Skelett, Tänder |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Filteruppsättningar som används i fluorescensförvärv är designade kring de stora våglängderna som används i fluorescensapplikationer, som är baserad på de mest använda fluoroforerna.Av denna anledning är de också uppkallade efter fluoroforen de är avsedda för avbildning, såsom DAPI (blå), FITC (grön) eller TRITC (röd) filterkuber.
| Filteruppsättning | Excitationsfilter | Dichroisk spegel | Barriärfilter | LED-lampa Våglängd |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-Auramin | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Texas Red | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Hur väljer man ett fluorescensfilter?
1. Principen för att välja fluorescensfilter är att låta fluorescens/emissionsljuset passera genom bildänden så långt som möjligt och samtidigt helt blockera excitationsljuset för att erhålla det högsta signal-brusförhållandet.Speciellt för tillämpningen av multifotonexcitation och totalt internreflektionsmikroskop kommer det svaga bruset också att orsaka stor störning av bildeffekten, så kravet på signal/brusförhållande är högre.
2. Känn till excitations- och emissionsspektrumet för fluoroforen.För att konstruera en fluorescensfilteruppsättning som genererar en högkvalitativ, högkontrastbild med svart bakgrund, bör excitations- och emissionsfilter uppnå hög transmission med minimal passbandsrippel över de regioner som motsvarar fluoroforexcitationstopparna eller emissionerna.
3. Tänk på hållbarheten hos fluorescensfilter.Dessa filter måste vara ogenomträngliga för intensiva ljuskällor som genererar ultraviolett (UV) ljus som kan leda till "utbrändhet", särskilt av exciterfiltret eftersom det utsätts för belysningskällans fulla intensitet.
De olika fluorescerande provbilderna
Resurserna samlas in och organiseras på Internet och används endast för lärande och kommunikation.Om det finns några intrång, kontakta oss för att radera.
Posttid: 2022-09-09